LABORATOORNE TÖÖ
Listeria monocytogenes tuvastamine ja loendamine toorest linnulihast (Eesti Maaülikooli veterinaarmeditsiini V kursuse üliõpilaste toidupatogeenide praktikum)
Eesti standard: EVS-EN ISO 11290-2:2000 – Toiduainete ja loomasööda mikrobioloogia. Horisontaalmeetod Listeria monocytogenes´e tuvastamiseks ja loendamiseks. Osa 1: tuvastamismeetod;
ISO 11290-2:1998(E) - Toiduainete ja loomasööda mikrobioloogia. Horisontaalmeetod Listeria monocytogenes´e tuvastamiseks ja loendamiseks. Osa 2: loendamismeetod.
| Palcam agarilt Listeria monocytogenes loendamise tulemus. Nagu fotol näha on antud linnuliha tootes arvukalt ohtlike toidupatogeene. Foto autor: Mati Roasto, 2010 |  |
Sissejuhatus:
L. monocytogenes on väike (1,0-2,0 μm x 0,5 μm), grampositiivne, fakultatiivselt anaeroobne pulgakujuline bakter, mis on looduses väga laialdaselt levinud. Patogeen võib eksisteerida rakusiseselt monotsüütides või neutrofiilides ning tema nimi on tuletatud faktist, et ühekambrilise maoga (nakkusele vastuvõtlike) loomade perifeersest verest leitakse sageli arvukalt monotsüüte. Listeeriaid tuntakse listerioosi nimelise haiguse põhjustajana. Tegemist on zoonootilise haigusega, millesse nakatuvad nii loomad kui inimesed.
Listeria monocytogenes avastati esmakordselt juba sajand tagasi ning teda tunti kui listerioosi põhjustajat. Viimasel aastakümnel tuntakse L. monocytogenes´t toidu kaudu leviva patogeenina. Enne aastat 1981 oli Listeria tuntud loomade patogeenina ning arvati, et inimesed saavad nakkuse otsese kontakti kaudu nakatunud loomadega. Tänapäeval on teada, et kontamineeritud toiduainete kaudu on võimalikud nii sporaadilised kui ka epideemilised haigusjuhtumid. Toidupõhise listerioosi vältimiseks on vajalikud põhjalikud teadmised haigusest, vastuvõtlikest inimestest, organismi levikust keskkonnas ning tekitaja seosest toiduga. L. monocytogenes´e laia leviku tõttu looduses kontakteeruvad inimesed temaga sageli, kuid sellega ei kaasne ilmtingimata infektsiooni teke. L. monocytogenes esineb sageli tervete inimeste roojas, mis viitab, et organismiga kokkupuutumine on sage. Uuringud on näidanud, et koguni 5% inimestest kannavad gastrointestinaaltraktis tekitajaid. Alates ajast, mil inimeste listerioosi esmakordselt kirjeldati, tuntakse listerioosi haigusena, mis esineb harva, kuid lõpeb sageli patsiendi surmaga. Täiskasvanutel väljendub listerioos tõsise haigusena nagu meningiit, septitseemia, baktereemia, endokardiit, konjuktiviit ning gripi taoline haigus (palavik, värinad, iiveldus, krambid, oksendamine ja diarröa). Gastrointestinaal sümptomeid esineb ühel kolmandikul juhtudest.
Ettevaatusabinõud praktikumis:
1. Praktikumis tööta üksnes kinnastatud kätega ning PEA MEELES, ET TÖÖTAD PATOGEENIDEGA.
2. Töö sooritamine eeldab hoolikat aseptilist tehnikat.
3. Tööpindade saastumisel desinfitseeri kohe saastunud kohad etanooli või mõne teise desinfektandiga.
4. Töövahendite paigutamisel järgi juhendajate juhiseid ning häid laboratooriumi tavasid.
Kõikide külvide sooritamise juures on vaja markeerida tassid ja katseklaasid enne külvama asumist. Külvidega Petri tassid pannakse kasvama põhi ülespoole.
TÖÖ KÄIK:
Esimene labor
1. Esimese lahjenduse (10-1) saamiseks võta steriilne Stomacher kilekott ja kasutades steriilseid pintsette ja kääre kaalu 10 grammi toorest linnulihaproovi (soovitavalt nahka) steriilsesse Stomacheri kilekotti ja lisa 90 ml steriilset puhverdatud peptoon-vett (lahjend e. lahjendusvedelik). Sega proov ühtlaselt kasutades Stomacher-tüüpi homogenisaatorit ja loksuta proovi selles 30 – 60 sekundit.
2. Võta kaks valmis Palcam agariga Petri tassi ühe proovi kohta ning markeeri tassid.
3. Kanna 0,1 ml 10-1 lahjendust e. algsuspensiooni kahele Petri tassile e. mõlemale Palcam agariga tassile 0,1 ml alglahjendust.
4. Inkubeeri plaate aeroobsetes tingimustes temperatuuril 37 ºC 24 tundi.
Teosta järgnevad etapid ettekasvatatud PALCAM plaatidega
1. Teosta PALCAM söötmel kasvavate kolooniate kontroll.
Listeria monocytogenes on hallikas rohelised kolooniad ning peaksid ümbritsetud olema tumedast tsoonist.
2. PALCAM agaril olevad tüüpilised kolooniad külvatakse vereagaril sektoritesse (agarile tehakse 3-5 sektorit). Tavaline külv + sissetorge agarile, et pärast inkubatsiooni teha kindlaks hemolüüsi olemasolu.
3. Veriagari inkubeerimine: 37 ºC 24 tundi.
Teine labor
Listeria monocytogenes loendamine:
Vaatle Petri tassil väljakasvanud kolooniaid. Tüüpilised L. monocytogenes kolooniad on hallikas rohelised ning peaksid ümbritsetud olema tumedast tsoonist. Vigade vältimiseks on oluline eraldada lahustamata toote osakesed kolooniatest. Laialivalgunud kolooniad loenda kui üksikkolooniad. Kui vähem kui veerand tassi on kaetud laialivalgunud kolooniatega, loenda kolooniad ülejäänud tassi osal ja selle põhjal arvuta kolooniate arv tassil. Kui üle veerandi tassist on kaetud laialivalgunud kolooniatega eemaldatakse tass loendamisest.
Üldiselt tuleks loendada plaadid, mis sisaldavad 15 kuni 150 kolooniat ja see eeldab kahe järjestikuse lahjenduse kasutamist loendamisel. Meie katses on tegemist ainult 10-1 lahjendusega sest eeldame, et kolooniate arv plaadil on väike. Seega kasutame loendamise meetodit, kus mõlemad plaadid sisaldavad vähem kui 15 kolooniat:
N = Σa
V x n x d
kus:
N – mikroobide arv milliliitris või grammis
Σa on kahel plaadil loetletud tüüpiliste kolooniate summa;
V plaadile külvatud lahjendusvedeliku kogus milliliitrites;
n plaatide arv (meie katses 2);
d lahjendusfaktor (meie katses 10)
Väljenda tulemused järgnevalt:
arvatav L. monocytogenes arvukus per gramm toodet
NÄIDE loetlemine andis järgnevad tulemused:
— esimesest lahjendusest (10-1) saadi, 12 ja 13 kolooniat:
N = 12 + 13 = 25 = 1250
0,1 x 2 x 10-1 0,02
Saadud tulemus ümarda kahe esimese arvuni. Kui ümardatavaks numbriks on 5 ja sellele ei järgne teisi arve, siis ümarda järgnevalt: 11500 ümarda 12000 ja 28500 ümarda 28000. Kui 5‑le eelnenud arv on paaritu arv, siis lisandub sellele üks, kui 5‑le eelnenud number on paarisarv, siis jääb see muutmatuks.
Ümardades tulemused meie näite puhul (1250) on kampülobakterite arvatav/hinnatav arvukus N 1200 ehk 1,2 x 103 mikroorganismi grammis või milliliitris tootes.
| Listeria monocytogenes loendamine V kursuse toidupatogeenide laboratoorse määramise ja loendamise praktikumis. Foto autor: Mati Roasto, 2010 |  |
Hinda vereagaril tüvede kasvu ja hemolüüsi olemasolu. Hemolüüsi vaata plaadi põhjalt otse kasvu tsooni alt.
Hemolüüsi põhjustanud tüvedega teosta tõestustestid ehk tüüpiliste pesade biokeemiline kontroll.
Katalaastesti teostamiseks vali makromorfoloogiliste tunnuste alusel välja tüüpiline Listeria monocytogenes´e koloonia ning kasutades steriilset külviaasa kanna materjal alusklaasile.
Sama külviaasa kasutades hajuta koloonia alusklaasi keskpinnale ning seejärel tilguta 1 tilk 3% vesinikperoksiidi (H2O2) uuritava bakterimassi pinnale. Positiivsest reaktsioonist annab märku kiire hapnikumullikeste eraldumine.
Listeria monocytogenes on katalaaspositiivse.
Oksüdaastesti teostamiseks kasuta kommertsiaalseid oksüdaastikke (Oxoid).
Võta oksüdaastikkude purgist välja 1 oksüdaastikk ning vii selle reagendiga immutatud ots kokkupuutesse plaadil kasvava tüüpilise Listeria monocytogenes´e kolooniaga.
Eemalda oksüdaastikk kolooniast ning jälgi positiivse reaktsiooni teket 40 sekundi jooksul. Positiivse reaktsiooni korral värvub tiku reagentidega ots värvus tume lillaks või siniseks. Listeria monocytogenes on oksüdaasnegatiivne.
Teosta gram-värvimine, selleks valmista märgpreparaat, lase sellel õhu käes kuivada ning fikseeri termiliselt.
Fikseeritud preparaati värvi 1 minuti jooksul kristallvioletiga.
Pese preparaati ettevaatlikult mõne sekundi jooksul destilleeritud veega.
Aseta preparaadile 1 minutiks 1 tilk värsket Lugoli (joodi) lahust.
Pese preparaati destilleeritud veega.
Dekoloreeri preparaati 30 sekundi jooksul dekoleraatoriga või 96 %-lise etanooliga.
Pese preparaati 5 sekundi jooksul destilleeritud veega ja kuivata ettevaatlikult filterpaberi ribaga.
Värvi preparaati 20-30 sekundi jooksul 0,25 %-lise safraniini lahusega.
Pese preparaat, kuivata preparaat ja mikroskopeeri õliimmersioonis.
Listeeriad värvustuvad grampositiivselt ehk tumesiniselt.
Listeria monocytogenes on lühike, grampositiivne kepikujuline bakter.
CAMP testi tegemine: igast rühmast 3-4 tudengit teevad lCAMP testi kasutades laminaarkappi.
CAMP testi olemus: külvid teostatakse vereagarile (laminaarkapis) ning kasutatakse ette kasvatatud L.m, S. aureus ja R. equi kultuuri. CAMP-testis on oluline kultiveeritavate tüvede (kontrollitavate tüvede külvamisel) jätta 1‑2 mm vahed S. aureus´e külvijoone ja R. equi külvijoone vahele. Petri tasse inkubeeritakse aeroobses keskkonnas 37 ºC juures 24 tundi.
| CAMP-testi külvijoone muster Allikas: kood 12 |  |
Teosta CAMP testi hindamine
L. monocytogenes´e ja S. aureus´e kasvu kokkupuute kohas peab olema hemolüüs.
| A külvijoonel kasvab Listeria monocytogenes B külvijoonel kasvab Staphylococcus aureus Kasvu kokkupuute kohas on selge hemolüüs Allikas: kood 12 |  |
| A Listeria ivanovii ja C Rhodacoccus equi kasvu kokkupuute kohas on näha haamripea kujuline moodustis Allikas: kood 12 |  |
L. ivanovii ja S. aureus vahel on negatiivne reaktsioon.
| Sellel fotol on näha kogu CAMP-testi tegelikku olemust Foto autor: Mati Roasto, 2010 |  |
Listeria monocytogenes on ramnoos positiivne ning ksüloos negatiivne.
| Fotol on näha suhkrute kasutamise test-tuubid (taamal) ja CAMP-testid termostaatkapis 37 kraadi juures. Foto autor: Mati Roasto, 2010 |  |
Iga laborpraktikum peab lõppema sellega, et kontrollitakse üle kas kõik külvid said paigutatud õige temperatuuriga termostaatkappidesse; kas kõik plaadid ja katseklaasid on õigesti märgistatud ja kas laboratoorium on sama korras nagu enne laborpraktikumi alustamist. Labortööd peavad toimuma korrektsete ja hügieeniliste töövõtetega.